La Flux balance Analysis (abbreviata da adesso in poi come FBA) è un metodo matematico che permette la simulazione, e l’analisi, di vie metaboliche in ricostruzioni su scala genomica, ovvero nella totalità del pathway cellulare interessato. Al contrario di modelli tradizionali, la FBA non richiede costi computazionali troppo onerosi, e permette perciò il trattamento di network metabolici molto ramificati in tempistiche accettabili anche su calcolatori di media potenza. Nonostante la formulazione dell’algoritmo alla base della FBA, risalga alla fine degli anni ’70, solo di recente ha visto un pieno riconoscimento della sua effettiva utilità nel campo della ricerca. Questa metodologia permette di visualizzare come si distribuiscano i flussi delle reazioni all’interno del pathway stesso, indicando la variazione in termini di “importanza” (o meglio propensità di reazione) di ciascun flusso in rapporto alle situazioni simulate.

Prima di passare a una trattazione più specifica della FBA è necessario chiarire alcuni concetti alla base delle riflessioni che portarono Palsson a formulare l’algoritmo della FBA

 

Una piccola introduzione alla legge di azione di massa

La legge della reazione di massa (Waage and Guldberg, 1864) stabilisce che la frequenza con cui una reazione avviene è proporzionale alla probabilità di una collisione fra i reagenti. Per una reazione del genere:

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Il rate di reazione può essere espresso come

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O più generalmente

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Dove mi e mi sono rispettivamente le molecolarità di Sj e Pj. Un approccio con equazioni differenziali porterebbe a queste equazioni

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La costante di equilibrio Keq caratterizza il rapporto fra substrati e prodotti in condizioni di equilibrio, ovvero quello stato del sistema in cui la velocità di comparsa e di scomparsa di prodotti e substrati si eguaglia. Ciò implica anche che in funzione del tempo non vi è una modificazione netta delle concentrazioni. Le costanti di velocità sono correlate alla Keq dalla seguente equazione

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Coefficienti stechiometrici

I coefficienti stechiometrici denotano la proporzione di substrati e prodotto coinvolti nella reazione.

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I coefficienti sono -1; -1; 2. Notare che non sono univocamente determinati. Se la medesima reazione viene letta in senso opposto essi cambiano in -2; 1; 1

In un network metabolico, comprendente m specie chimiche e r reazioni, la dinamica del sistema è descrivibile dal equazioni di questo genere

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Dove nij sono i coefficienti stechiometrici della specie i nella reazione r.

 

Matrici stechiometriche

I coefficienti stechiometrici possono essere usati per costruire le cosiddette matrici stechiometriche

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In queste matrici ogni colonna rappresenta una reazione, e ogni fila un substrato

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Flux Balance Analysis

Il principio alla base della FBA è la conservazione della massa. Un bilancio del flusso per ogni metabolita (Xi) può essere scritto, all’interno di un sistema metabolico, per ottenere una equazione del bilancio di massa che interconnetta i vari metaboliti

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Per un network metabolico che contiene m metaboliti, e n flussi, tutti i bilanci transienti possono essere descritti da un singola matrice

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La costante tempo che caratterizza le reazioni sono, solitamente, molto rapide se comparate con le tempistiche di crescita cellulare. Per cui l’equazione del bilancio di massa viene semplificata considerando il comportamento all’equilibrio (dX/dt = 0)

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L’equazione per il bilancio dei flussi è solitamente under-determined (m<n) e non può essere usata l’eliminazione gaussiana per trovarne il determinante. Molti ricercatori hanno collezionato sufficienti dati sui flussi esterni, ma per poter essere usati necessitano alcune assunzioni addizionali, come per esempio ignorare certe reazioni all’interno della cellula. Inoltre i flussi metabolici interni sono stati anche essi misurati. Fare questo però non è sempre possibile, e la maggior parte delle volte è unicamente possibile determinare i flussi solo di alcuni sottosistemi della rete metabolica. L’approccio più comune per la risoluzione di sistemi under-determinated consiste nell’applicare soluzioni di programmazione lineare. La programmazione lineare può essere espressa in forma canonica

massimizzazione cTx

soggetto a Sv = 0

e limite inferiore ≤ x ≤ limite superiore

In questo caso x rappresenta il vettore di variabili da determinare, mentre c è un vettore di coefficienti già conosciuti nel sistema. Questo genere di equazioni sono denominate funzioni obiettivo, e guidano la tipologia di analisi che può essere impostata con questo sistema.

Il grosso vantaggio della FBA è che, come si è visto, non sono necessarie conoscenze specifiche sulle concentrazioni delle specie chimiche in gioco, o più importante ancora, i coefficienti cinetici degli enzimi del pathway, proprio grazie all’assunzione dello stato stazionario come stato di riferimento del sistema. I coefficienti stechiometrici sono sufficienti per la massimizzazione matematica della funzione obiettivo. Oltre al bilancio di massa è possibile impostare numerose altre tipologie di funzione obiettivo, fra cui:

· Massimizzazione della crescita cellulare, comunemente impostata come massimizzazione della produzione di biomassa

· Massimizzazione della produzione di una determinata specie chimica

· Minimizzazione del consumo energetico, o massimizzazione della produzione di energia (intesa come produzione di ATP, NADPH e NADH)

Lasciamo la trattazione matematica di questi aspetti alla curiosità del lettore.

 

Constrains

Uno degli aspetti chiave, e punto di forza della FBA, è la capacità di impostare determinati vincoli che descrivano meglio il sistema in esame, oppure che guidino o che indirizzino i flussi del network incanalandoli in determinati valori. Anche qui le tipologie di constrains che si possono imporre sono varie, e devono venir attentamente soppesate al momento di impostare l’analisi, onde evitare da un lato di creare troppo vincoli che maschererebbero la risposta, e dall’altra di omettere certi aspetti che potrebbero essere invece determinanti nell’indirizzare i flussi delle reazioni. Constrains tipici, che vengono quasi sempre implementati nel sistema sono:

· Constrains che limitino la velocità di uptake/secrezione delle specie chimiche (generalmente nutrienti)

· Constrains che regolino la direzione delle reazioni in accordo con considerazioni di tipo energetico

· constrains dovuti alla natura finita delle velocità di reazione delle cellule

Ulteriori constrains sono specifici delle singole situazioni sperimentali che si vuole simulare. Entrano in gioco quindi fattori come la presenza o l’assenza di determinati nutrienti o metaboliti nel mezzo di crescita (o se l’analisi concerne solo uno specifico compartimento cellulare la presenza di determinate specie chimiche nell’ambiente esterno al compartimento), oppure valori di velocità di flussi precedentemente determinati sperimentalmente, ma anche necessità di bilancio di cariche.

 

Tipologie comuni di analisi, la delezione di Geni/Reazioni

Un impiego sempre più frequente della FBA è quello di andare a monitorare come cambino i flussi delle reazioni in seguito alla delezione di uno o più geni. Questo può portare all’identificazione di alcuni geni fondamentali per il pathway in quanto codificanti per specie chimiche (che siano enzimi o regolatori) essenziali per il circuito metabolico. Oppure può mostrare un grado di ridondanza funzionale se la capacità del pathway metabolico di espletare la propria funzione non viene intaccata dalla delezione. Un evento simile concettualmente è quello di inibire una reazione, affinché il flusso che passa da essa cali drasticamente. I risultati di questa tipologia di analisi possono essere vari, ma sommariamente riassumibili in due casistiche. Il flusso all’interno dell’intero pathway cessa, e quindi la reazione o il gene su cui si è operata una modifica risulta chiave per il pathway stesso. Sempre più di frequenza invece si vede come i sistemi metabolici possiedano la capacità di modificare i propri flussi virandoli verso reazioni secondarie, che in caso di perturbazione da una situazione “normale” operano per ristabilire un optimum in risposta alla perturbazione. La FBA mostra molto bene questa variazione nei flussi

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